Bahasa :
SWEWE Anggota :Login |Pendaftaran
Cari
Masyarakat ensiklopedia |Ensiklopedia Jawaban |Kirim pertanyaan |Pengetahuan kosakata |Upload pengetahuan
Sebelumnya 1 Berikutnya Pilih Halaman

Plasmid

Plasmid (plasmid) melekat pada sel-sel DNA kromosom non-sel atau wilayah nuklir yang mampu replikasi otonom dari molekul DNA asli yang lebih kecil (yaitu, sel-sel dengan hasil gabah, hasil gabah dan sel lampiran). Meskipun sebagian besar plasmid adalah konfigurasi melingkar, tetapi juga menemukan bahwa sebagian kecil dari konformasi linier plasmid, yang hadir dalam banyak bakteri dan ragi dan organisme lain, dan bahkan tanaman di mitokondria dan organel lainnya.Pengantar singkat

Plasmid (plasmid) melekat pada sel-sel DNA kromosom non-sel atau wilayah nuklir yang mampu replikasi otonom dari molekul DNA asli yang lebih kecil (yaitu, sel-sel dengan hasil gabah, hasil gabah dan sel lampiran). Meskipun sebagian besar plasmid adalah konfigurasi melingkar, tetapi juga menemukan bahwa sebagian kecil dari konformasi linier plasmid, yang hadir dalam banyak bakteri dan ragi dan organisme lain, dan bahkan tanaman di mitokondria dan organel lainnya. Plasmid pasangan basa DNA alami panjang dari ribuan hingga ratusan ribu pasangan basa miliki. Plasmid alami hadir dalam organisme ini dalam sel yang kadang-kadang dapat memiliki beberapa plasmid bahkan dalam waktu yang sama. Jumlah salinan plasmid (jumlah salinan) dalam sel-sel dari tunggal untuk ribuan yang mungkin. Kadang-kadang beberapa plasmid mengandung gen resistensi (seperti E. coli yang mengandung gen resistensi tetrasiklin memiliki plasmid). Ada beberapa plasmid yang membawa gen dapat memberi metabolisme sel fisiologis tambahan, dan bahkan di beberapa bakteri untuk meningkatkan virulensi. Secara umum, ada atau tidak adanya sel inang plasmid bertahan tanpa peran yang menentukan. Ini adalah rekayasa genetik yang paling umum carrier. [1]

Replikasi plasmid dalam sel

Replikasi plasmid dalam sel umumnya dua jenis: tipe kontrol yang ketat (kontrol ketat

) Dan tipe kontrol longgar (kontrol Santai). Yang pertama adalah hanya tahap tertentu dalam siklus replikasi sel, ketika replikasi kromosom, tidak bisa meniru, biasanya dalam setiap sel hanya berisi satu atau beberapa molekul plasmid, seperti faktor F. Yang terakhir plasmid setiap saat sepanjang siklus sel dapat direplikasi di banyak salinan per sel, umumnya lebih dari 20, seperti Col E1 plasmid. Menggunakan sintesis protein inhibitor - kloramfenikol, sintesis protein, replikasi DNA kromosom dan pembelahan sel dihambat, replikasi plasmid kompak berhenti sambil terus relaksasi replikasi plasmid, jumlah salinan plasmid amplifikasi harus dikurangi dari lebih dari 20 untuk 1000-3000, bila kandungan DNA total DNA plasmid dapat dari 2% menjadi 40-50%. Menggunakan sistem replikasi yang sama, plasmid tidak dapat hidup berdampingan dalam sel inang yang sama, ketika dua plasmid diperkenalkan ke dalam sel yang sama, mereka akan disalin dan kemudian ditugaskan ke sub-sel dalam proses saling bersaing dalam beberapa sel, plasmid mewakili keuntungan, sedangkan pada sel lain, plasmid lain memiliki tangan atas. Ketika, setelah beberapa generasi pertumbuhan sel, minoritas plasmid akan hilang, dan dengan demikian hanya dua keturunan dalam sel sebagai plasmid, fenomena yang disebut ketidakcocokan plasmid (Ketidaksesuaian). Namun, sistem replikasi menggunakan plasmid yang berbeda dapat stabil berdampingan dalam sel inang yang sama. Plasmid umumnya mengandung gen penyandi enzim tertentu, termasuk ketahanan fenotipik terhadap antibiotik, menghasilkan antibiotik tertentu, degradasi senyawa organik kompleks untuk menghasilkan enterotoksin dari E. coli dan hormon tertentu dan pembatasan endonuklease dan enzim modifikasi.

Vektor plasmid

Sebuah tujuan yang berguna dari fragmen DNA oleh teknologi DNA rekombinan, yang akan dikirim ke propagasi sel penerima dan alat ekspresi yang disebut vektor (Vector). Plasmid bakteri umumnya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan pembawa. Plasmid yang mengandung molekul sendiri adalah replikasi dari struktur genetik. Plasmid juga dengan beberapa informasi genetik, maka akan diberikan ke beberapa sel inang sifat genetik. Dan kemampuannya untuk informasi genetik mereplikasi diri yang dilakukan oleh manipulasi DNA rekombinan, seperti amplifikasi, proses penyaringan sangat berguna.

Plasmid vektor adalah plasmid berdasarkan alam untuk beradaptasi dengan laboratorium untuk operasi manual dari membangun. Dibandingkan dengan plasmid alami, vektor plasmid biasanya dengan satu atau lebih gen penanda dipilih (seperti gen resistensi antibiotik) dan terdiri dari sejumlah sintetik situs pengenalan restriksi endonuklease dari beberapa kloning urutan situs, dan menghapus sebagian besar urutan non-esensial, sehingga dapat mengurangi berat molekul, untuk rekayasa genetika. Urutan vektor yang paling plasmid dengan beberapa tujuan tambahan, penggunaan tersebut termasuk visual diidentifikasi dengan metode histokimia klon rekombinan, dihasilkan untuk penentuan urutan DNA beruntai tunggal, in vitro transkripsi urutan DNA eksogen, fragmen mengidentifikasi arah penyisipan gen asing sejumlah besar ekspresi, dll Sebuah vektor kloning substansial ideal harus memiliki beberapa fitur berikut: ⑴ berat molekul kecil, beberapa salinan, relaksasi jenis kontrol; ⑵ digunakan dengan berbagai pembatasan endonuklease tunggal titik potong; ⑶ sumber eksternal dapat dimasukkan ke dalam sebuah fragmen DNA yang lebih besar; ⑷ memiliki dua atau lebih penanda genetik untuk memfasilitasi identifikasi dan screening. ⑸ berbahaya bagi sel inang. Plasmid vektor digunakan umumnya berkisar dalam ukuran antara 1kb sampai 10kb, seperti pBR322, PUC seri, pGEM seri, dan pBluescript (disebut sebagai PBS) dan sebagainya.

Ketidakcocokan plasmid

Menggunakan sistem replikasi yang sama, plasmid tidak dapat hidup berdampingan dalam sel inang yang sama, ketika dua plasmid diperkenalkan ke dalam sel yang sama, mereka akan disalin dan kemudian ditugaskan untuk setiap sel anak selama kompetisi. Dalam beberapa sel, dominan plasmid, sedangkan pada sel lain, plasmid lain adalah menang. Ketika, setelah beberapa generasi pertumbuhan sel, minoritas plasmid akan hilang, dan dengan demikian hanya dua keturunan dalam sel sebagai plasmid, fenomena yang disebut ketidakcocokan plasmid (Ketidaksesuaian). Namun, sistem replikasi menggunakan plasmid yang berbeda dapat stabil berdampingan dalam sel inang yang sama. Plasmid umumnya mengandung gen penyandi enzim tertentu, termasuk ketahanan fenotipik terhadap antibiotik, menghasilkan antibiotik tertentu, degradasi senyawa organik kompleks untuk menghasilkan enterotoksin dari E. coli dan hormon tertentu dan pembatasan endonuklease dan enzim modifikasi. [2]

Plasmid diekstraksi dari bakteri metode

DNA plasmid diisolasi dari bakteri metode meliputi tiga langkah dasar: budaya bakteri amplifikasi plasmid, pemanenan dan melisiskan sel, Isolasi dan pemurnian DNA plasmid. Menggunakan kuat alkali, panas atau lisozim (terutama untuk bakteri Gram-positif) dapat menghancurkan dinding sel bakteri, natrium sulfat dodesil (SDS) dan TritonX-100 (jarang digunakan) memungkinkan lisis sel. Lisozim dan SDS atau Triton X-100 pengobatan, fragmen DNA kromosom bakteri yang melekat pada sel pada luka, dan karena DNA kromosom bakteri plasmid besar daripada rentan terhadap tindakan mekanis enzim dan asam nukleat dipotong menjadi berbeda ukuran fragmen linier. Ketika panas atau asam kuat, perlakuan alkali, DNA kromosom bakteri terdenaturasi linear, kovalen ditutup DNA sirkular (Kovalen ditutup circularDNA, disebut cccDNA) dari dua rantai tidak akan terpisah satu sama lain, ketika kondisi eksternal dikembalikan, baris fragmen DNA kromosom seperti renaturasi keras, tapi dengan protein terdenaturasi dan puing-puing sel terjerat bersama-sama, dan DNA plasmid beruntai ganda dan restitusi, re-pembentukan molekul supercoiled alam, dan keadaan terlarut dalam fase cair. Pada sel bakteri, kovalen tertutup bentuk plasmid supercoiled. Dalam proses plasmid, selain supercoiled DNA, plasmid akan menghasilkan bentuk lain dari DNA. Jika dua untai DNA plasmid dalam rantai rusak dalam satu atau lebih molekul dapat diputar untuk memutus rantai ketegangan, pembentukan siklik molekul jenis santai, yang disebut loop terbuka DNA (Open circularDNA, disebut ocDNA), jika plasmid kedua untai DNA istirahat di tempat yang sama, pembentukan DNA linear (LinearDNA). Ketika dimurnikan elektroforesis DNA plasmid, DNA plasmid yang sama supercoiled membentuk berenang lebih cepat dari molekul loop terbuka dan linier berenang kecepatan.

DNA plasmid diisolasi dari bakteri dari operasi tertentu

Bahan, peralatan dan reagen

I. Bahan

PBS yang mengandung E.coliDH5α atau JM seri strain, 1.5ml tabung centrifuge plastik (juga dikenal sebagai eppendorf tube), rak tabung.

Kedua, perangkat

Ambil dispenser mikro (20μl, 200μl, 1000μl), kecepatan tinggi centrifuge desktop temperatur osilasi gemetar, uap bertekanan tinggi sterilisasi (autoclave), Vortex, elektroforesis, aparat elektroforesis agarosa dan rata suhu konstan air mandi, dll .

Ketiga, reagen

1, media cair LB (Luria-Bertani): Timbang pepton (Trypton) 10g, ekstrak ragi (Yeastextract) 5g, NaCl10g, dilarutkan dalam 800ml air deionisasi dan disesuaikan dengan pH 7,5 dengan NaOH, tambahkan air deionisasi untuk total volume 1 liter uap bertekanan tinggi disterilkan selama 20 menit.

2, LB padat media: media cair ditambah agar 12g per liter, autoclave.

3, ampisilin (Ampisilin, Amp) minuman keras: dijuluki solusi 50mg/ml, -20 ℃ untuk menyimpan cadangan.

4, solusi lisozim: Gunakan 10mmol/LTris · Cl (pH8.0) dirumuskan sebagai 10mg/ml, dan didistribusikan ke dalam porsi kecil (misalnya 1.5ml) disimpan pada suhu -20 ℃, setiap sedikit setelah saya pernah digunakan dibuang.

5,3 mol / lNaAc (pH5.2): 50ml dilarutkan 40.81gNaAc · 3H2O, disesuaikan dengan pH 5,2 dengan asam asetat, menambah volume air 100ml, aliquot diautoklaf disimpan pada 4 ℃ kulkas.

6, solusi 1:50 mmol / L glukosa, 25mmol / LT ri s Cl. (PH8.0), 10mmol/LEDTA (pH8.0). Ⅰ larutan yang dibuat dalam batch, setiap botol 100ml, diautoklaf selama 15 menit, disimpan pada 4 ℃ kulkas.

7, solusi Ⅱ: 0.2mol/LNaOH (Pro 10mol/LNaOH cairan induk diencerkan sebelum digunakan), 1% SDS.

8, solusinya Ⅲ: 5mol/LKAc60ml, glasial 11.5ml asam asetat, H2O28.5ml, mengatur volume sampai 100 ml, dan diautoklaf. Konsentrasi akhir larutan: K 3 mol / L, Ac ˉ 5mol / L.

9, RNA enzim Sebuah solusi ibu: larut dalam RNA-ase A 10mmol/LTris · Cl (pH7.5), 15mmol/LNaCl di 10mg/ml dijuluki

Larutan dipanaskan pada 100 ℃ selama 15 menit untuk menonaktifkan enzim dicampur dalam DNA. Setelah pendinginan 1.5mleppendorf tabung ke aliquots kecil yang disimpan pada suhu -20 ℃.


Sebelumnya 1 Berikutnya Pilih Halaman
Pemakai Ulasan
Belum ada komentar
Saya ingin komentar [Pengunjung (44.200.*.*) | Login ]

Bahasa :
| Periksa kode :


Cari

版权申明 | 隐私权政策 | Hak cipta @2018 Dunia pengetahuan ensiklopedis