| Bahasa : |
|
| Masyarakat ensiklopedia |Ensiklopedia Jawaban |Kirim pertanyaan |Pengetahuan kosakata |Upload pengetahuan |
Polymerase chain reaction |
 |
|
Polymerase chain reaction (PCR): in vitro amplifikasi DNA. PCR menggunakan polimerase termostabil, dan dua basis yang terdiri dari 20 primer beruntai tunggal. Setelah denaturasi suhu tinggi dari DNA template dipisahkan menjadi dua rantai, sehingga suhu rendah anil primer dan template beruntai tunggal dengan, maka perpanjangan suhu, larutan reaksi diikuti oleh primer nukleotida bebas dari 5 'ke 3' sintesis komplementer rantai baru. Yang baru disintesis DNA dan dapat terus loop, sehingga jumlah DNA terus bertambah banyak.Tujuan eksperimental Melalui percobaan ini untuk mempelajari prinsip-prinsip dasar reaksi PCR, operasi dasar dari teknik PCR untuk menguasai, dan elektroforesis agarosa gel. PRINSIP PCR untuk amplifikasi urutan diketahui pada kedua ujung segmen DNA, yaitu dengan memperpanjang primer untuk sintesis DNA mengulangi cara. Prinsip dan prosedur dasar adalah sebagai berikut: Siklus PCR, ada tiga peristiwa yang berbeda terjadi: (1) Template denaturasi, (2) primer anil, (3) DNA polimerase untuk sintesis DNA. 1. TS: pemanasan DNA cetakan pada suhu tinggi (94-95 ℃) denaturasi untai ganda mematahkan ikatan hidrogen antara dua bentuk beruntai tunggal, langkah denaturasi. 2. Annealing: suhu sistem diturunkan menjadi 37-65 ℃, DNA template dan primer komplementer mengikat oleh dasar-pasangan prinsipnya, primer ke untai template dan 3 ', membentuk DNA beruntai ganda parsial, langkah anil. 3. Perpanjangan: Sistem suhu reaksi dinaikkan dengan suhu 72 ℃, tahan panas DNA polimerase DNA beruntai tunggal sebagai template, di bawah bimbingan dari primer, campuran reaksi menggunakan empat trifosfat Deoksinukleotida (dNTP), 5 'ke 3 'arah meniru DNA komplementer, yaitu primer fase ekstensi. Sebuah siklus dari tiga langkah, yaitu denaturasi panas, temperatur anil, suhu berbaring tiga tahap. Secara teoritis, masing-masing melalui loop, jumlah DNA dalam sampel harus dua kali lipat, rantai lingkaran yang baru dibentuk dapat menjadi template untuk babak baru, setelah 25 sampai 30 siklus DNA dapat diperkuat dengan 106-109 kali ( Keenam partai harus 10-10 untuk kesembilan, adalah Baidu tidak bisa bermain dalam notasi ilmiah, sehingga menulis 106-109). Sebuah komposisi reaksi PCR khas dari komponen-komponen berikut: template DNA, reaksi penyangga, dNTP, MgCl2, dua primer DNA sintetis, panas-DNA Taq polimerase (enzim Taq dari bakteri Thermus aquaticus Thermus aquaticus (Taq) di terisolasi termostabil polimerase DNA untuk aplikasi PCR memiliki tonggak penting, enzim dapat mentolerir suhu di atas 90 ℃ dan belum hidup, tidak setiap siklus enzim, sehingga teknik PCR telah menjadi sangat Sederhana, tetapi juga sangat mengurangi biaya, teknologi PCR dapat menjadi sejumlah besar aplikasi, dan secara bertahap diterapkan secara klinis.). Elektroforesis gel agarosa Prinsip Prinsip elektroforesis gel agarosa: Agarose adalah molekul polimer rantai panjang alami dilarutkan dalam air mendidih, 45 ℃ mulai membentuk kaku lubang saringan berpori, ukuran pori gel tergantung pada konsentrasi agarosa. Molekul DNA dalam lingkungan alkalin dengan muatan negatif, medan listrik diterapkan pada berenang positif. Molekul DNA dalam gel agarosa mobilitas, efek biaya dan efek saringan molekul. DNA yang berbeda, ukuran molekul dan konfigurasi mobilitas elektroforesis mereka berbeda ketika tingkat berbeda, dan dengan demikian membedakan antara zona yang berbeda. Dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa DNA, adalah penggunaan efek saringan molekuler, kecepatan migrasi dan berbanding terbalik dengan logaritma dari berat molekul. Etidium bromida (EB) rata molekul yang memancarkan fluoresensi di bawah sinar ultraviolet. Molekul DNA dengan EB kompleks EB-DNA, intensitas emisi emisi fluoresensi dari negara bebas intensitas fluoresensi EB 10 kali atau lebih, dan intensitas fluoresensi sebanding dengan kandungan DNA. Dengan mata telanjang, dapat dideteksi lebih dari 5 ng DNA. Bahan dan Reagen DNA genomik, primer gen spesifik, PCR amplifikasi reagen terkait, Taq enzim Prosedur eksperimental 1. Ekstraksi DNA template: yang dihasilkan DNA genom percobaan beras. 2. PCR operasi (di atas es): (1) PCR reaksi campuran persiapan: sistem reaksi 25 μ L, secara steril 0,2 mL tabung centrifuge dengan pipetting prosedur berikut: (2) pencampuran campuran reaksi kemudian dimuat setiap PCR tabung 24 μ L mengukir campuran reaksi, ditambah 1 μ L cetakan DNA, dan akhirnya tambahkan 1 tetes minyak mineral untuk mencegah penguapan air, Kemudian sedikit demi sentrifugasi. (3) tabung PCR ke pengendara sepeda termal PCR, untuk memulai siklus prosedur berikut: (4) Kewaspadaan Karena PCR sensitivitas sangat tinggi, sehingga langkah-langkah harus diambil untuk mencegah campuran reaksi dengan kontaminasi DNA Trace. a. Semua reagen PCR terkait, hanya digunakan untuk percobaan PCR, daripada tujuan yang dimaksudkan. b. operasi yang digunakan dalam tabung PCR, tabung centrifuge, kelas pipet yang digunakan hanya sekali. c. masing-masing ditambah satu reaktan, harus mendapatkan tip baru (pipet plastik nozzle dikenal). 3. Deteksi produk PCR: Konsentrasi agarosa (1,2%), konsentrasi EB (5 μ l / 100 ml TBE) (1) lem (misalnya untuk 150 mL) a. Timbang 1,8 g agarosa, tambahkan 150 ml TBE penyangga (pH 8,0), shake flask menggunakan keseimbangan elektronik, mengatakan total berat badan. |
| Pemakai Ulasan |
|
Belum ada komentar |
